Свято-Амвросиевская базилика была построена свят. Амвросием Медиоланским в 379-386 гг. в районе Верчелльских ворот, где были похоронены христиане, замученные римскими преследованиями, — свв. Виктор, Набор, Феликс, Валерия, Гервасий и Протасий. Св. Амвросий хотел поместить в ней мощи всех миланских мучеников. Она стала первой из четырех базилик, построенных св. Амвросием за стенами древнего Медиолана в последней четверти IV века.
Первоначально новая базилика была освящена св. Амвросием в честь римских мучеников, супружеской пары Хрисанфа и Дарии. Затем, когда святитель обрел мощи свв. Гервасия и Протасияв 380 году и положил их здесь, она получила название «мученическая» (Basilica Martyrum). Уже много лет спустя после смерти св. Амвросия, между IX и XI веком, базилика была переименована в Свято-Амвросиевскую, поскольку здесь были помещены мощи святителя.
С IV по XIII век создавалась красивейшая мозаика апсиды Свято-Амвросиевской базилики. В центре мозаики изображен Господь Иисус Христос, сидящий на престоле. Два ангела по бокам Спасителя венчают мученическими венцами свв. Гервасия и Протасия. Внизу изображено одно из чудес, совершенных св. Амвросием: однажды он уснул прямо во время совершения литургии, и в это же самое время чудесным образом явился в Туре на погребении свят. Мартина Турского (справа и слева внизу). В медальонах под троном Спасителя изображены брат и сестра св. Амвросия прав. Сатир, преп. Марцеллина, а также мц. Кандида, которую особенно почитали члены семьи святителя.
В IX веке создавался знаменитый золотой престол, возвышающийся над криптой с мощами, пример искусства Каролингов. С лицевой стороны престола на рельефах из сусального золота, украшенных драгоценными камнями и перегородчатой эмалью, изображены сцены Страстей Христовых, с обратной стороны — рельефы из позолоченного серебра со сценами из жития свят. Амвросия. Сень над престолом датируется X веком и украшена сверху изображением Иисуса Христа, дающего ключи апостолу Петру и Евангелие апостолу Павлу.
В XI веке базилика была перестроена и обрела свой нынешний романо-ломбардский вид, но план ее точно соответствовал плану первоначального здания: трехнефная базилика без трансепта и с двориком (атриумом). В X и XII веке строятся две башни: «колокольня монахов» и «колокольня каноников».
С VIII по XV век вокруг базилики существовал бенедиктинский монастырь, в к. XV века бенедиктинцев сменили цистерианцы, открывшие в монастыре большую общественную библиотеку. С X века в базилике проходили коронации императоров Священной Римской империи как королей Италии со знаменитой Железной короной Ломбардии.
В XV веке по заказу бенедиктинцев знаменитый архитектор Донато Браманте, служивший при дворе миланского герцога Лодовико Моро, спроектировал внутренний дворик и боковые капеллы, к храму была присоединена часовня св. Виктора на златом небе. В этой часовне сохранились уникальные мозаики V века, среди которых — образы свят. Матерна с мчч. Набором и Феликсом, и самое древнее изображение свят. Амвросия, сохранившее черты портретного сходства, с мчч. Гервасием и Протасием.
В эпоху барокко базилика была отчасти реконструирвована, но в сер. 19 века зданию был возвращен романский вид. Она была разбомблена во время Второй мировой войны в 1943 году и отреставрирована. Фасад Свято-Амвросиевской базилики вдохновил создателей Калифорнийского университета в Лос-Анжелесе.